• Document: COSTRUZIONE DI GENOTECHE
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COSTRUZIONE DI GENOTECHE Definizione di genoteca Una genoteca è una collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. ¾ Genoteche di DNA genomico ¾ Genoteche di DNA cromosomico ¾ Genoteche di cDNA GENOTECHE DI DNA GENOMICO Perché costruire una genoteca genomica? Per mappare il genoma. Per identificare/isolare un gene. Tappe per la costruzione di una genoteca genomica 1. Isolamento del DNA da un organismo 2. Taglio del DNA in frammenti 3. Legame dei frammenti di DNA con un vettore di clonaggio opportunamente scelto 4. Trasferimento del vettore ricombinante nell’organismo ospite 5. Selezione del clone contenente il gene di interesse 6. Recupero del vettore ricombinante e del frammento di DNA di interesse Caratteristiche di una genoteca genomica Una genoteca per essere utile deve essere completa e rappresentativa: rappresentativa deve contenere tutto il genoma di un organismo e ogni parte del genoma deve essere ugualmente rappresentata Per ottenere una genoteca con tali caratteristiche è necessario tagliare il genoma in FRAMMENTI GRANDI (per clonarli in vettori di clonaggio ad alta capacità) CASUALI (generati da tagli casuali) OMOGENEI (aventi tutti la stessa lunghezza) PARZIALMENTE SOVRAPPONIBILI (caratteristica essenziale per il mappaggio ed il sequenziamento di geni molto grandi) Taglio del DNA genomico in frammenti grandi e casuali • Rottura meccanica (Si generano frammenti con estremità piatte) Sonicatore Siringa ad ago molto sottile • Digestione enzimatica parziale (Si generano frammenti con estremità piatte o sporgenti a seconda dell’enzima utilizzato) Produzione dei frammenti da clonare per digestione enzimatica parziale Per ottenere una digestione parziale bisogna limitare la quantità e/o il tempo di incubazione dell’enzima con il DNA genomico. Prima del clonaggio bisogna selezionare i frammenti in base alla loro lunghezza. ……ma quanti cloni sono necessari per ottenere una genoteca completa????? • dimensione del genoma (esempio: genoma umano 2,8 x 106 kb) • dimensione media dei frammenti da clonare (esempio 20 kb) Calcolare: n: grandezza del genoma / dimensione media dei frammenti da clonare n: 2,8 x 106 kb / 20 kb = 1,4 x 105 frammenti Considerando la variabilità e la casualità del clonaggio, abbiamo bisogno di ottenere un numero di cloni ricombinanti ben maggiore di n per ottenere una genoteca completa. E’ possibile calcolare esattamente il numero di cloni ricombinanti in relazione alla probabilità di includere una data sequenza nella genoteca: ln(1-P) ln(1-0,95) ln(1-0,99) N= N= = 4,2 x 105 N= = 6,5 x 105 ln(1-1/n) ln(1-1/ 1,4 x 105) ln(1-1/ 1,4 x 105) N= numero di cloni necessari per avere una genoteca completa P= probabilità che una regione genomica qualsiasi sia inclusa nella genoteca; ln= logaritmo naturale del numero in parentesi Dimensioni ottimali di genoteche genomiche in funzione dei vettori utilizzati Organismo Dimensione Tipo di Dimensione P Dimensione del genoma vettore Dell’inserto della libreria Batterio 4 × 106 Plasmide 4 kb 0.99 4.6 × 103 Fago λ 18 kb 0.99 1.0 × 103 Cosmide 40 kb 0.99 458 BAC 300 kb 0.99 59 Mammifero 3 × 109 Plasmide 4 kb 0.99 3.5 × 106 Fago λ 18 kb 0.99 7.7 × 105 Cosmide 40 kb 0.99 3.5 × 105 BAC 300 kb 0.99 4.6 × 104 Costruzione di una genoteca genomica rappresentativa in vettori λ Charon 4A Maniatis et al., 1978 Costruzione di una genoteca genomica rappresentativa in vettori λ EMBL GENOTECHE DI DNA CROMOSOMICO GENOTECHE DI DNA CROMOSOMICO Mediante l’uso di un apparecchio chiamato FACS, FACS Fluorescence Activated Cell Sorter, si possono isolare singoli cromosomi umani sulla base delle loro dimensioni. Una volta separato qualche milione di cromosomi di un solo tipo, se ne può estrarre il DNA e farne una genoteca come se si trattasse di un normale genoma. Esistono 24 genoteche cromosomiche umane: una per ciascuno dei 22 autosomi, una per l’X e una per Y. Il vantaggio delle genoteche cromosomiche è che richiedono un numero di cloni dalle 10 alle 30 volte inferiore a quello richiesto per una genoteca genomica e permettono una maggiore rapidità nell

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